飛凡檢測(cè)可依據(jù)YY/T 0606.25-2014 進(jìn)行動(dòng)物源性生物材料DNA殘留量測(cè)定法：熒光染色法試驗(yàn)，動(dòng)物源性生物材料DNA殘留量測(cè)定法：熒光染色法試

YY/T 0606.25-2014標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)過(guò)程解析

飛凡檢測(cè)試驗(yàn)步驟：

本試驗(yàn)方法所采用的實(shí)驗(yàn)方案包括三個(gè)步驟:(1)動(dòng)物源性生物材料的蛋白酶K消化(適用于固體或膠體狀材料)，(2)消化后樣品的DNA純化(磁珠吸附法)，(3)純化后樣品的 DNA 殘留量測(cè)定(熒光染色法)。試驗(yàn)樣品除供試品之外，需同步設(shè)定回收率試驗(yàn)樣品(使用標(biāo)準(zhǔn)品Lambda DNA)。

材料：試劑和儀器

準(zhǔn)備：

試劑：1(蛋白酶K消化用試劑:蛋白酶K(-20?保存，避免反復(fù)凍存和融化)，蛋白酶K

緩沖液。 2(DNA純化用試劑:磁珠(4?保存)、裂解液、DNA結(jié)合液、漂洗液、溶出液(室溫保存)。3(熒光染色法檢測(cè)試劑:PicoGreen 染料。

儀器：磁力架，96 孔板(黑色)，熒光酶標(biāo)儀，DNase-free無(wú)菌離心管;吸頭，冷凍離心機(jī)，震蕩器，漩渦混懸器，高精度天平(0.00001g)

飛凡檢測(cè)試驗(yàn)步驟：

注明:以下試驗(yàn)過(guò)程中必須采取防止 DNAase 污染的措施，如:戴手套操作、使用沒(méi)有 DNAase 污染的專用實(shí)驗(yàn)臺(tái)和實(shí)驗(yàn)用具及儀器。

1.干燥型樣品:取供試品(100 ug)，jingque稱重并記錄，放進(jìn)1.5 mL DNase-free無(wú)菌離心管內(nèi)，用無(wú)菌眼科剪將樣品剪裁成適當(dāng)大小，加 DEPC水至180UL，于冰箱內(nèi)放置 12,24 小時(shí)，使樣品充分水和、軟化。

2.濕潤(rùn)型樣品:取供試品(1 cm)，放于1.5 mLDNase-free無(wú)菌離心管內(nèi).13000rpm/min 離心10 min，去除液體部分。另取與上述同樣大小的樣品，分別放于1.5mLDNase-free無(wú)菌離心管內(nèi)，13000rpm/min離心10min，去除液體部分后以開(kāi)蓋狀態(tài)放在安全柜內(nèi)，令其室溫內(nèi)自然干燥24 小時(shí)，jingque稱重并記錄，用于樣品干重單位重量?jī)?nèi)DNA殘留量的計(jì)算。

3.膠體型樣品:jingque量取供試品 100 uL，放于1.5 mLDNase-free無(wú)菌離心管內(nèi)，可直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

注:膠體型樣品:以單位體積的殘留 DNA 含量表示最終結(jié)果。

4. 骨質(zhì)類樣品:對(duì)于諸如同種異體骨等骨植入物樣品應(yīng)參照GA/T 383-2002中華人民共和國(guó)公共安全

注:每份樣品設(shè)平行樣三份，最終測(cè)定結(jié)果取其平均值。

5.將上述供試品剪成盡量小的碎片后，加蛋白酶K緩沖液(10xProteinase K buffer)20uL，蛋白酶K(20mg/mL)10uL，加DEPC水至最終反應(yīng)體積為210u L。

注:液態(tài)狀樣品不需要蛋白酶K消化，可直接進(jìn)行后續(xù)的 DNA 純化試驗(yàn)。

6.取DNA 標(biāo)準(zhǔn)品(Lambda DNA standard)400ng、200ng、100ng、50ng、25ng、Ong，用DEPC水稀釋至100uL，分別加在1.5 mLDNase-free無(wú)菌離心管內(nèi)，添加蛋白消化酶K緩沖液20u L，蛋白酶K(20 mg/mL)10u L，3% BSA 80uL(目的是保證與供試品反應(yīng)系統(tǒng)相同)，至最終反應(yīng)體積為 210uL。

7.依據(jù)所選擇的方法及使用的試劑盒所附的操作方法進(jìn)行 DNA純化。

TMTM 舉例:使用核酸提取試劑盒(PrepSE Acid Extraction

Kit)進(jìn)行DNA純化 ， 在上述各樣品中分別加入裂解液 400uL，震蕩10秒鐘使樣

品充分混勻，室溫放置10min，使樣品完全溶解(最多可放置 1-2 小時(shí)，直至樣品完全溶解)。

8.取出裝有磁珠的離心管，以“最大速度”震蕩 10 秒鐘混勻后，取30uL磁珠液分別加入上述各樣品內(nèi)，“低速”震蕩 10 秒鐘混勻。加入 400u L結(jié)合液(異丙醇)，震蕩5秒鐘。室溫下震蕩(1000 rpm/min)孵育10分鐘。低速震蕩 10 秒鐘后，將內(nèi)裝樣品的離心管放在磁力架上，收集結(jié)合有DNA 的磁珠，去除上清液。 漂洗 DNA:加入300uL洗液，低速震蕩10秒鐘后，將內(nèi)裝樣品的離心管放在磁力架上，收集結(jié)合有 DNA的磁珠，去除上清液。

9.重復(fù)步驟:漂洗DNA，至少2次。使結(jié)合有 DNA 的磁珠在室溫下干燥5分鐘。溶出DNA:加入50uL溶出液，中速震蕩5分鐘，于70度水浴槽內(nèi)孵育5分鐘，中速震蕩2秒鐘后，將內(nèi)裝樣品的離心管放在磁力架上，分離 DNA。

飛凡檢測(cè)數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)方法中回收率試驗(yàn)最低樣本量為 6.25 ng DNA,低于6.25 ng 時(shí)回收率明顯下降，不能滿足良好的準(zhǔn)確性和精密度。本試驗(yàn)方法中適宜的樣本量為?6.25 ng DNA/樣品。若樣品中 DNA殘留量低于 6.25 ng DNA/樣品時(shí)，應(yīng)加大樣品的取樣量，相應(yīng)地?cái)U(kuò)大蛋白酶K消化時(shí)的反應(yīng)體積。

如果在最大取樣量的條件下仍不能滿足上述條件，則只能報(bào)告未經(jīng)回收率校正的檢測(cè)值作為參考資料，此種情況在最終報(bào)告中應(yīng)注明。